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组合突变提高甲基对硫磷水解酶MPH热稳定性的研究-论文

发布时间:

中国农 业科技导报 , 2 0 1 5 ,1 7 ( 1 ) : 1 6 7 -1 7 2  
J o u r n a l   o f   A g ic r u l t u r l  a S c i e n c e   a n d   T e c h n o l o g y  

组合 突 变 提 高 甲基 对硫 磷 水 解 酶 MP H 热 稳 定 性 的研 究 
罗 晓亮  ,   顾杏露  ,   田   健  ,   初 晓宇  ,   伍 宁丰  
( 1 . 中国农业科 学院生物技术研究所 , 北京 1 0 0 0 8 1 ; 2 . 扬州大学生物科学与技术学 院 , 江苏 扬州 2 2 5 0 0 9 )   摘 要: 来源于苍 白杆菌 O c h r o b a c t r u m  s p . M2 3 1的甲基对 硫磷 水解酶 M P H . O c h具 有优 良的催化水 解 甲基对 

硫磷农 药的能力 , 针对其 热稳 定性较差 的缺点 , 通 过组合 3种提高蛋 白热稳定性的突变策略 , 最终获得热稳定 
性改 良的突变 酶 MP HM 7 , 其  达到 6 5  ̄ C, 在之 前研 究 热稳 定性 提高 的 四点突 变酶 ( S 2 7 4 Q / T 1 8 3 E / K1 9 7 L /   ¥ 1 9 2 M) 的基 础上又提高 了 5  ̄ C。同时 , 该突变酶 的催 化效 率也 获得了一定 的提 高 , 其  / K m 值 是 四点 突变酶  的3 . 8 倍 。热稳定性 改 良突变酶的获得证实 了这些提 高热稳 定性 的方法是 有效 的 , 并且 其作 用具有 加合性 ,  

这为分子设计改 良酶蛋 白热稳定性提供 了新 的研 究思路 。  
关键 词 : 甲基对硫磷水解 酶 ; 热稳定性 ; 组合突变 
d o i : 1 0 . 1 3 3 0 4 / j . n y k j d b . 2 0 1 4 . 7 3 4  

中图分类号 : Q 9 3 5  

文献标识码 : A  

文章编号 : 1 0 0 8 — 0 8 6 4 ( 2 0 1 5 ) 0 1 — 0 1 6 7 — 0 6  

S t u di e s   o n   En ha nc i n g   The r mo s t a bi l i t y   o f   Me t hy l   Pa r a t hi o n 
Hy d r o l a s e   by   Co mb i na t o r i a l   M ut a g e ne s i s  
L UO   Xi a o — l i a n g   ,GU   X i n g . 1 u   ,T I AN   J i a n  ,C HU   Xi a o   y u   ,W U   Ni n g - f e n g  
( 1 . B i o t e c h n o l o g y   R e s e a r c h   I n s t i t u t e ,C h i n e s e   A c a d e my   o f   A g n c u h u r a / S c i e n c e s ,B e r i n g   1 0 0 0 8 1 ;   2 . C o l l e g e   o f   B i o s c i e n c e   a n d   B i o t e c h n o l o g y , Y a n g z h o u   U n i v e r s i t y ,J i a n g s u   Y a n g z h o u   2 2 5 0 0 9, C h i n a )  

Ab s t r a c t : T h e   m e t h y l   p a r a t h i o n   h y d r o l a s e( MP H— O c h )f r o m   O c h r o b a c t r u m   s p . M2 3   1   e x h i b i t s   b e t t e r   c a t a l y t i c   a c t i v i t y  
t h a n   o t h e r   MP Hs .I n   o r d e r   t o   i n c r e a s e   e n z y me   t h e r mo s t a b i l i t y,3   d i f e r e n t   s t r a t e g i e s   we r e   u s e d   w i t h   c o mb i n a t o r i a l   mu t a g e n e s i s .As   a   r e s u l t ,t h e   o f   t h e   mu t a n t   e n z y me   MP HM7   w a s   a p p r o x i ma t e l y   6 5  ̄ C. T h e   t e mp e r a t u r e   wa s   5  ̄ C  

h i g h e r   t h a n   t h a t   o f   MP H M 4 , t h e   mu t a n t   w i t h   4   p o i n t   m u t a t i o n s( S 2 7 4 Q / T 1   8 3 E / K 1 9 7 L / ¥ 1 9 2 M) . A t   t l l e   s a m e   t i m e ,   t h e   c a t a l y t i c   c a p a c i t y(  n /   )o f   MP H M7   w a s   u p   t o   3 . 8 一 f o l d   o f   MP H M4 . he T   s u c c e s s   o f   t h e s e   d e s i g n   me t h o d o l o y  g
f o r   MPH  s u g g e s t e d   t ha t   i t   wa s   a n   e ic f i e nt   s t r a t e g y   or f   e n ha n c i n g   t h e r mo s t a bi l i t y   a n d  i t   h a d   a dd i t i v i t y   pr o pe r t y.Thi s  

s t u d y   h a d   p r o v i d e d   a   n e w  t h o u g h t   or f   mo l e c u l a r   d e s i g n i n g   t o   i mp r o v e   e n z y me   p r o t e i n   t h e r mo s t a b i l i t y .   Ke y   wo r d s : me hy t l   p a r a hi t o n   h y d r o l a s e ;t h e r mo s t a b i l i t y ;c o mb i n a t o r i a l   mu t a g e n e s i s  

有 机磷农 药 可 以破 坏 乙 酰 胆碱 酯 酶 的活 性 ,   从而引 发 一 系列 神 经 中毒 症 状 , 甚 至 导 致 死  亡¨ J 。大量使用有机磷农 药后 , 环境 中残 留农药  的污染 如 何 消 除 成 为 人 们 关 注 的 热 点 问 题  。   有机 磷 降解 酶 ( o r g a n o p h o s p h o r u s   h y d r o l a s e , E C 3 . 1 .   8 . 1 ) , 是 一种 可 以断 裂 有 机磷 农 药磷 酯 键 从 而使  其脱 毒 的酶  。其 中 , 甲基 对 硫 磷水 解 酶 ( me t h y l   p a r a t h i o n   h y d r o l a s e , M P H) 因其 最适 底 物是 甲基对 

目前 国际上对 于 甲基对 硫磷 水解 酶 的研究 还 

处 于起 步 阶段 , 它 们 大 都 是 在 中 国发 现 和分 离 得 

硫磷而被单独作为一类 。  
收 稿 日期 : 2 0 1 4 - 1 2 — 2 2 ; 接 受 日期 : 2 0 1 5 — 0 1 — 0 9  

到 的, 其 中来 源于 P s e u d o m o n a s  s p .WB C - 3 、   P l e s i o m o n a s   s p . M6和 O c h r o b a c t r u m  s p . M2 3   1的 甲   基对 硫磷 水解 酶 氨 基 酸 序 列相 似性 很 高 , 最 低 为  9 8 . 2 %, 它 们 在 酶 学 性 质 上 表 现 出 的共 同特 点 是  催 化 甲基 对 硫磷 的效率 高 , 碱性 条件 利 于催化 , 热  稳定 性 较 差  。 只 有 从 P s e u d o m o n a s   p s e u d o a l —   c a l i g e n e s 分离出的 O P H C 2 具有较好的热稳定性 ,  

基金项 目: 国家 自然科学基金项 目( 3 1 1 0 0 0 4 9 ) 资助。   作者简介 : § 罗晓亮与顾杏露为本文共同第一作者。罗 晓亮 , 本 科生 , 主要 从事酶工 程方面研 究。E - m a i l : 7 1 O 9 6 8 8 2 7 @q q . c o n l 。顾 

杏露 , 本科生 , 主要从 事生物工程 方面的研究 。E - m a i l : 1 2 4 8 6 0 5 2 5 3 @q q . e o m。   通信作者 : 初 晓宇 , 副研究 员, 博士 , 主  要从事应用微生物酶工程方面 的研究 。E — ma i l : c h u x i a o y u @e a / l  ̄ . e n  

1 6 8  

中 国 农 业 科 技 导 报 

1 7卷 

但是与上述几个 M P H的氨基酸序列最高相似性  仅有 5 8 . 5 %, 催 化 甲 基 对 硫 磷 的 能 力 不 如 
MP H   。上 述研 究结 果 表 明 , 热 稳 定 性 差是 制 约  具有 优 良催化 活性 的 甲基对 硫 磷 水 解 酶 M P H广  泛应 用 的关键 因 素之 一 , 因此 , 提高 M P H 的 热稳 
定性 , 研 究酶 蛋 白的分 子结构 与热 稳定 性 的关 系 ,   将 为酶蛋 白更 广泛 地应 用奠 定基础 。   多年 来 国 内外 学者 发现许 多 酶蛋 白其热 稳定  性 与蛋 白质 空 间结 构 的稳定 性密 切相 关 。蛋 白质 

突变 酶 。  

1 材 料 与 方 法 
1 . 1 实验 菌株 及质 粒  大肠 杆菌 表 达 菌 株 B L 2 1 ( D E 3 ) 购 自天 根 生 

化科 技 ( 北京) 有 限公 司 。带 有 四点 突变 甲基 对  硫磷 水解 酶基 因 的质 粒 p E T 一 3 0 . m p h m 4为本 实验 

室保 存 。  
1 . 2 实 验试剂 及 工具酶 

结 构 的稳 定性 又 与 酶 蛋 白的氨 基 酸 组成 特 性 、 蛋 
白质 分子 内 的作 用 力 ( 包 括 非共 价作 用 力 : 如 氢 

键、 疏水 作用 力 和静 电作用 力等 ; 共价 作用 力如 二  硫键 和金 属 离 子 结 合 力 等 ) 、 蛋 白质 构 象 的稳 定  性、 N末 端 和 C末 端 的稳 定性 、 蛋 白 结 构 中 环 
( 1 o o p ) 的稳 定 性 、 翻译 后 修 饰 等 多 个 方 面 的 因 素  相 关 ’  。同 时 , 针对 酶 蛋 白热 稳 定 性 优 化 方 面 ,  

甲基 对 硫 磷 购 自国 家 农 药 质 量 监 督 检 验 中  心; P C R用 F a s t   P f u聚 合 酶 以及 p E A S Y — U n i  
S e a m l e s s   C l o n i n g   a n d   A s s e m b l y   K i t 购 自北京 全式金 

生物技术 有 限公 司 ; 亲 和层 析 用树 脂 填料 N i . N T A  
A g a r o s e购 自 Q i a g e n公 司 ; 蛋 白质浓 度 测定 试剂 盒 

研 究者应 用 蛋 白质工程 等相 关技 术进 行 了多种 设  计 方案 的探 索和研 究 。有些 研究 者通 过改 造构 象 
不 稳定 区 段 , 如 引入 特 殊 结 构 的 氨基 酸 ( 如 丙 氨  酸、 脯氨酸 )  , m   以及 增 加 氢 键 …] 、 二 硫 键  等 

购 自B i o — R a d公 司 ; 其余试剂 均为 国产分析 纯 。  
1 . 3 组 合突 变 

在 之前 获得 的热 稳定性 改 良的四点 突变基 因  m p h m 4的 基 础 上 , 分 别 进 行 G1 9 4 P单 点 突 变 ,   P 7 6 D / P 7 8 K双 点突 变 和 P 7 6 D / P 7 8 K / G 1 9 4 P 三  点突 变 , 获 得 3个 突 变 基 因 m p h m 5 、 m p h m6和 
mph m7。  

增强构象稳定性 , 从 而 提 高 蛋 白质 的热 稳 定 性 。   有些 研 究者通 过 优 化 蛋 白质表 面 电荷 的分 布 , 获 
得 了稳定 性 提高 的 突变酶 ¨  。  

本 实验 室一 直致 力于有 机磷 降解 酶方 面 的研 
究 工作 , 从农 药 污染 的土 壤 中分 离得 到一 个 来 源 

以p E T - 3 0 一 m p h m 4质 粒 为 模 板 , 引物 p E T 3 0 .  
V — F和 G1 9 4 P R( 表 1 )扩 增 上 游 片 段 ,引 物 

于 苍 白 杆 菌 (O c h r o b a c t r u m  s p . )的 M P H — O c h  

G1 9 4 P F和 p E T 3 0 一 V — R扩 增 下 游 片 段 , 反 应 体 系 
5 0  L : 5 x F a s t   P f u缓 冲液 l 0  L , 2   m mo l / L   d N T P s   5  L , 上、 下游 引 物 各 3   L, 模板 D N A1  I L L,  

( a c c e s s i o n   N o . : A C C 6 3 8 9 4 )   , 其 酶 反 应 的 最 适  反 应温度 仅 为 3 5 c c¨  。为 了提 高该 酶蛋 白 的热  稳 定性 , 之前 也采 用 了多种 策 略进行 突变研 究 , 将  构 象 不 稳 定 区段 的第 1 9 4位 甘 氨 酸 突 变成 脯 氨 
酸, 增强 了构 象稳 定 性 , 获得 G 1 9 4 P单点 突 变 酶 ,   其  。 比野 生 型提 高 了约 5  ̄ C   l 1 6 ] ; 通过 软件 计算 确  定 可能 影 响热稳 定 性 的氨 基 酸位 点 , 采 用 饱 和 突 

2 . 5   u /   L   F a s t   P f u聚 合 酶 1   L,d d H2 O   2 7   I x L 。  
扩增条件 为 : 9 5 ℃ 5   mi n ; 9 5 ℃ 4 5   S , 5 6 o C   4 5   S ,  
7 2  ̄ C   2   mi n , 共3 0个循 环 ; 7 2  ̄ C延伸 1 0   a r i n 。P C R  

产 物切 胶 回收后 进行 同源 重 组 ( 重 组 的详 细 方 法  请 见试 剂盒 说 明书 ) , 构建 p E T 。 3 0 . m p h m 5重组 质 
粒 。构 建 p E T 一 3 0 一 m p h m 6重 组 质 粒 是 以 p E T . 3 0 .   m p h m 4质 粒 为 模 板 , p E T 3 0 . V . F和 P 7 6 D / P 7 8 K R   为一 对 引 物扩 增 , P 7 6 D / P 7 8 K F和 p E T 3 0 一 V . R 为 


变后 筛 选 出 一 株 四点 突 变 酶 ( S 2 7 4 Q / T 1 8 3 E /   K1 9 7 L / S 1 9 2 M), 其  ( 酶 活损 失一 半 时的温 度 )  
比野 生 型 提 高 了 1 0 . 2  ̄ C¨  ; 在 MP H. O h c的 蛋 白 

表 面 引入 P 7 6 D / P 7 8 K双点 突 变 , 使得 这 两个 氨基  酸 之 间形成 一个 新 的离 子 键 , 从 而 提 高 了酶 蛋 白  的稳 定性 ¨  。这 些 设 计 策 略 都 已成 功 的 提 高 了 
该 酶蛋 白的热稳 定性 , 本文 在之 前研 究 的基础 上 ,   综 合增加 构 象稳 定 性 、 提 高 解 折 叠 自由能 和 在 蛋  白表 面 引入 离 子键 三 种 突变 策 略 对 MP H . O c h进  行进 一 步改 造 , 以期 获得 热 稳 定 性进 一 步 提 升 的 

对 引物扩 增 , 扩 增 条 件 和 重组 条 件 同上 。构 建 

p E T 一 3 0 - m p h m7时 使 用 p E T - 3 0 一 m p h m 6为 模 板 ,   G1 9 4 P F / R引 物 引 入 突 变 位 点 。重 组 质 粒 p E T .   3 0 ? m p h m 5、 p E T 一 3 0 一 m p h m 6和 p E T 一 3 0 - m p h m7分 别  转 化大肠 杆 菌表 达菌 株 B L 2 1 , 挑 取单 克 隆进 行 酶  切 鉴定 , 阳性 克 隆 由北 京 博 艾 永华 生物 科 技 有 限 
公 司进 行测 序 。  

1 期 

罗晓亮 等 : 组合 突变提高 甲基对硫 磷水 解酶 MP H热稳定性 的研究 

1 6 9  

注: 下划线所示为突变碱基 。  
No t e: Mu t a n t   b a s e s   we r e   u n d e li r n e d  

1 . 4 突变 甲基 对 硫 磷 水 解 酶 在 大 肠 杆 菌 中的 表 
达及 纯化 

活性 和底 物浓 度 采用 软 件 G r a p h P a d   P r i s m   5 . 0  

( G r a p h P a d   S o f t w a r e ,U S A) 进行 非线 性 拟 合 , 计 算 
出蛋 白质 的  和 k  。  

序 列 比对正 确 的突 变 体进 行 诱 导 表 达 , 首 先 
接 种 于含有 5 0   p  ̄ g / mL卡 那 霉 素 的 5 m L   L B培 养 

基 中, 3 7  摇床过夜振荡培养 。再将 过夜 培养菌  液以 1 %的接种 量 , 接种 到含 有 5 0   I .  ̄ g / m L卡 那 霉 
素的 5 0   m L   L B培养 基 中 , 振荡培养约 3   h ( O D   ∞  
达到 0 . 6 ~0 . 8 ) , 最后 , 加入 终 浓 度 为 0 . 4   mm o l / L  

2 结果 与分析 
2 . 1 突 变位 点 的选择 及突 变体 的构 建  针对 M P H - O c h蛋 白热 稳定 性 的改 良, 本 实验  室在 之前 的研 究 中通 过提 高解 折叠 自由能获得 了 
个 四点 突 变 体 M P H 4( S 2 7 4 Q / T 1 8 3 E / K 1 9 7 L /   ¥ 1 9 2 M) , 该 突 变 酶 的  。 提高 了 1 0 . 2 ℃  1 6 ] , 本 研 


I P T G诱 导剂 , 1 6 ℃诱 导 培养 1 5 ~1 6   h 。离 心 收集 
诱 导后 的 菌 体 , 加入 5   mL   T r i s . H C 1 ( 5 0   m mo L / L ,   p H   8 . 0) 缓 冲液 重 悬 , 超声 波 破碎 细 胞 ( 4 0   W,  

3   s / 次, 5   s / 次停 , 2 0 0次 ) , 收集 上 清 液 , 获 得 粗酶 

究在 这个 突变 体 的基础 上 引入稳 定蛋 白质构象 的 

液。由于使用 p E T 3 0 表达载体 , 在突变酶 的 N端  会带 有 H i s 标签 , 因此 采 用 N i 亲 和 层 析 进 行 纯  化, 具体 操作 步 骤 参 照 C h u等 _   的方 法 , 1 纯 化 后 
的蛋 白进 行 S D S . P A G E电泳检 测 。   1 - 5   突 变 甲基对硫 磷 水解 酶酶 学性 质测 定  甲基 对 硫 磷 水 解 酶 ( O P H C 2 ) 的 酶 活 性 测 定 

突变 位点 G1 9 4 P和离 子键 突变 位 点 P 7 6 D / P 7 8 K,   构建 了 五 点 突 变 体 M P H M5( S 2 7 4 Q / T 1 8 3 E /  
K 1 9 7 L / ¥ 1 9 2 M/ G1 9 4 P) 、六 点 突 变 体 M P H M6  
( S 2 7 4 Q / T 1   8 3 E / K 1 9 7 L / S   1 9 2 M/ P 7 6 D / P 7 8 K) 和 

七 点 突 变 体 MP H M7 ( S 2 7 4 Q / T 1 8 3 E / K 1 9 7 L /  
S 1 9 2 M / G1 9 4 P / P 7 6 D / P 7 8 K) 。P C R 扩 增 获 得 上 

参照 wu等  的方 法 。一 个 酶 活 性 单 位 ( U) 定 
义为 在 3 7  ̄ C 条 件下 , 每 分钟 释放 出 1   I  ̄ mo l 对 硝基 
酚所 需 的酶量  。  

游 片段约 3 . 0   k b , 下 游 片段 约 3 . 3   k b ( 图1 ) , 重 组  后转 化 大 肠 杆 菌 B L 2 1 , 提取 重 组 质粒 E c o R V /   N o t   I 酶切 鉴定 ( 图2 ) , 3个 重组 质 粒 均 可 以得 到  约9 0 0   b p的基 因条 带 和 约 5 . 4   k b的 载 体 条 带 。  

1 . 5 . 1   突 变 酶 热 稳 定 性 测 定  为 了保 证 不 同突 
变酶 蛋 白在耐 热 性 研究 中 的均 一 性 , 首 先 要 将 待  测 的酶蛋 白稀 释 到 同一 浓 度 4 0   i r g /   L ( 选择 这 个 

正确 的质 粒再进 行 测序 , 分析 比较 序列 , 确 定 已按  照设计 产 生 突 变 , 最 终 获 得 阳性 重 组 子 MP H M5 —  
2 、 MP HM 6 - 6和 M P H M7 — 1 。  

蛋白浓度是 为了保 温后易于测定酶活性 ) , 在不  同温 度 下 ( 5 0~7 0 ℃) 热处 理 1 0   mi n , 然 后 冰 浴  3 0   m i n , 再分别测定其剩余酶活性 , 计算后得 到该  酶蛋 白的  。 。   1 . 5 . 2   突 变酶的动 力学参数 测 定 在 5 0   m mo l / L  
T r i s — H C 1( p H   8 . 0 ) 缓 冲液 中 , 以 不 同 浓 度 的 甲基  对硫 磷 作底 物 , 测 定 酶蛋 白的活性 , 并将 测定 的 酶 

2 . 2 突变 甲基 对硫磷 水 解酶 的表 达及 纯化  为 了测定 突变 对 酶 蛋 白性 质 的影 响 , 需要 获  得纯 的 酶 蛋 白。 同 时 将 突 变 酶 MP H M4菌 株 、   MP H M5 — 2菌株 、 MP HM6 . 6菌株 和 M P H M7 - 1 菌 株  进行 I P T G诱 导 表 达 , 细 胞 破 碎 获 得 的粗 酶 液 通  过 亲和层 析 进行 纯 化 , 纯化后 S D S — P A G E 电泳 检 

1 期 

罗晓亮等 : 组合 突变提高 甲基对硫磷水解酶 M P H热稳 定性 的研 究 

1 7 1  

的热 稳定 性提 高 突变酶 的获 得再 次证 明 了这三 种 

3 讨 论 
目前 针对 蛋 白质 酶学 性 质 改 良 , 常 用 的策 略 

策 略对改 善蛋 白质 热稳 定 性 是 有 效 的 , 并 且 在 同 


个 蛋 白质热 稳定 性改 良中实现 了增 强构 象稳 定 

性、 增加离 子键 和 提 高 鳃 折 叠 自由能 三 种 策 略 的  综 合 应用 。之 前 的研 究 报 道 常为 一 种 策 略 , 本研   究为 通过 理性 设计 提高 酶蛋 白的热稳 定性 提供 了 
新 的研究 思路 。此 外 , 突变酶 热 稳定性 的提升 , 可  以实 现 MP H— O e h的工 业 化 生 产 中产 率 的 进 一 步 

主要包括随机突变筛选 、 定 向进 化和理性设计等  策略。*些年 , 计算机模拟技术 和蛋 白质结构解 
析技 术在 不 断发 展 和 完 善 , 有关 蛋 白质结 构 方 面 
的数 据量 也在 飞速 增加 , 同时 , 越 来越 多 的研究 者 

获得 了关于突变体热稳定性方 面的实验数据 , 因   此, 通过计 算 找 出可 能 影 响 蛋 白质 热稳 定 性 的氨  基酸 和结构 元件 , 进 行 理性 设 计 的定 点 突 变 已经 
成 为 一条 高效 可靠 的研究 途 径 。   作 为 具有 独立 催 化 能 力 的 酶 蛋 白 , 热 稳 定 性  是其 在产 业化 应用 中 的一个 至关 重要 的参 数 。针  对 酶 蛋 白热稳定 性 的 改 良, 许 多 研 究 者 进 行 了大  量 的研 究 工作 。离 子键 对蛋 白质 的热 稳定 性具 有  非常 重要 的作 用 , 一 条 途 径 是通 过 引入 离 子 键 优 
化 酶 蛋 白表面 电荷 [ 1   。在 MP H. O h c的蛋 白表  面引 人 P 7 6 D / P 7 8 K双点 突变 , 在 天冬 氨 酸和赖 氨 

提高 和成本 的降低 。   本研究 中获 得 突变 体 M P H M5 、 M P H M6和  MP H M7除 了  相 对 MP H M 4都有 不 同程 度 的提  升, 在 测 定 酶 学 性 质 的 时 候 发 现 MP H M6 和  M P H M7突 变 酶 的 催 化 效 率 也 有 不 小 的 提 高 , 这 

种提高出现在引入离子键 的突变体中 , 而没有加 
入 离 子键 的 MP H M5突 变 酶 , 催 化 效 率 并 没 有 改  变, 说 明催 化效 率 的提 高 可 能 与离 子 键 的引 入有 
关系 , 具体 的原 因还 在进 一步 分 析和研 究 之 中。  
参 考 文 献 

酸之 间可 以形 成 一个 新 的离 子 键 , 进 而提 高 了该  酶蛋 白的稳 定 性 ¨ 引。另 一 条 途 径 是 增 加 蛋 白质  构象稳 定 性 , 脯 氨 酸是组 成蛋 白质 的 2 0种 氨基 酸 

[ 1 ] 黄 斌, 汪春红 . 甲基对硫磷慢性 毒性研究进展 [ J ] . 环境与 

健康杂志 , 2 0 0 8 , 2 5 ( 6 ) : 5 5 6 — 5 5 8 .  
Hu a n g   B. Wa n g   C   H.S t u d y   p r o g r e s s   o n   c h r o n i c — t o x i c   e  ̄e t s   o f  

m e t h y l   p a r a t h i o n [ J ] .J .E n v i r o n .H e a l t h,2 0 0 8 , 2 5( 6) : 5 5 6  


中刚性最强的氨基酸 , 蛋 白质构象不稳定 的区段  引入 脯氨 酸可 以增 加蛋 白质 的刚 性  j , 从 而提 高  蛋 白质 的热 稳 定性 [ 1 0 , 2 3 ] 。 田健 等 _ 1 刮通 过 将 构 象 
不稳 定 区段 的第 1 9 4位 甘 氨 酸 突 变 成 脯 氨 酸 , 增  强 了构象 稳 定 性 , 获得 了 G 1 9 4 P单 点 突变 酶 , 其  比野 生型 提高 了约 5 ℃ 。本 研究 以之前研 究 为  基础 , 综合 考虑 多种 稳定 蛋 白质 的结构 因素 , 在 甲  基对 硫磷 水解 酶 MP H— O e h解 折 叠 自由能 的突 变 
体 MP H M4( S 2 7 4 Q / T 1 8 3 E / K1 9 7 L / S 1 9 2 M) 基 础 

5 5 8 .  

[ 2 ] P a n u w e t   P ,P r a p a m o n t o l  T ,C h a n t a r a   S ,e t   a 1 . .U i r n a r y  
p a r a n i t r o p h e n o l ,a  me t a b o l i t e  o f   me t h y l  p a r a t h i o n, i n  Th a i  

f a r m e r   a n d   c h i l d   p o p u l a t i o n s[ J] .A r c h .E n v i r o n .C o ma m.  
T o x i e o 1 . , 2 0 0 9 , 5 7 ( 3 ) : 6 2 3 — 6 2 9 .  

[ 3 ] 初晓宇. 来源 于假单胞菌的 甲基对硫磷水解酶 O P H C 2功能 
与 结 构 关 系 的 研究 [ D] . 北 京 :中 国 农 业 科 学 院 , 博 士 后 论  文, 2 0 1 0 .  
Ch u  X Y. R e s e a r c h  o n  t h e  r e l a t i o n s hi p  b e t we e n  c a t a l y t i c  

f u n c t i o n   a n d   s t r u c t u r e   o f   Ps e u d o mo n a s   p s e u d o a l c a l i g e n e s   me t h y l  

p ra a t h i o n   h y d r o l a s e , O P HC 2[ D] .B e i j i n g : C h i n e s e   A c a d e m y  
0 f   A  c u k u r a l   S c i e n c e s ,Po s t   Do c t o r   Di s s e r t a t i o n,2 0 1 0 .  

上, 引入了突变位点 G 1 9 4 P和 P 7 6 D / P 7 8 K, 进行  了组 合 突 变 研 究 , 获得 了 M P H M 5 、 M P H M 6和  MP HM7三 种 突 变 酶 , 其 热 稳 定 性 较 之 前 得 到 的  热稳 定性 最 好 的突变 酶 MP HM4进 一 步增 强 。新 

[ 4 ] 徐 玮, 林 恒, 刘卫东 , 等. 邻单胞菌 M 6中甲基对硫磷水解 
酶( MP H) 的纯化 及性 质 的研究 [ J ] . 高 技术 通讯 ,2 0 0 6 ,  
1 6: 8 4-8 7 .  

Xu  W . L i n   H. L i u   W   D. e t   a 1 . . P u i r ic f a t i o n  a nd  

c h a r a c t e i r z a t i o n   o f   me t h y l   p ra a t h i o n   h y d r o l a s e( MP H) f r o m 

1 7 2  

中 国 农 业 科 技 导 报 

1 7卷 

P l e s i o m o n a s   s p . M6 [ J ] . C h i n . Hi g hT e c h n o 1 . L e t t . , 2 0 0 6 , 1 6:  
8 4 -8 7 .  

i n t e r a c t i o n s [ J ] . P r o c . N a t 1 . A c a d . S c i . U S A , 2 0 0 9 , 1 0 6 ( 8 ) :  
2 6 01 - 26 0 6.  

[ 5 ] 楚晓娜 ,张先恩 ,陈亚 丽,等. 假 单胞菌 WB C . 3甲基对硫 
磷 水 解 酶 性 质 的 初 步研 究 [ J ] . 微 生 物学 报 , 2 0 0 3 ,4 3 : 4 5 3  


[ 1 4 ]  肖 玮 ,初晓字 ,田 健 ,等. 来 源于苍 白杆菌 的甲基 对硫磷  水解酶 基 因的 克 隆 [ J ] . 中 国农 业 科 技 导 报 ,2 0 0 8 ,1 0  
( S 1 ): 9 9 —1 0 2 .  
Xi a o   W,C h u  X Y, T i a n  J, e t   a 1 . . Cl o n i n g  o f  a  me t h y l  

4 5 8 .  

Ch u   X N , Z h a n g  X  E, Ch e n  Y L, e t   a 1 . .S t u d y  o n  t h e   p r o p e r t i e s   o f   me t h y l   p a r a t h i o n   h y d r o l a s e   f r o m  Ps e u d o mo n a s   s p .  

p a r a t h i o n   h y d ol r se a   g e n e   f r o m   O c h r o b a c t r u m。 p . [ J ] . J .A g i r c .  
S c i . T e c h n o 1 . , 2 0 0 8 ,1 0 ( S 1 ): 9 9 — 1 0 2 .  

WB C 一 3[ J ] .A e t a   Mi c r o b i o 1 . S i n . , 2 0 0 3 , 4 3: 4 5 3 — 4 5 8 .  

[ 6 ]   肖 玮.甲基对硫磷降解 菌的筛选及其 甲基对硫磷水解酶基  因的克 隆 [ D] . 北 京 :中 国农 业 科 学 院 ,硕 士 学 位 论 
文, 2 0 0 8 .  
Xi a o   W .S c r e e n i n g   o f   b a c t e ia r   wi t h   t h e   c a p a b i l i t y   o f   d e g r a d i n g   me t h y l   p a r a t h i o n   a n d   c l o n i n g   o f   a   me t h y l   p a r a t h i o n   h y d r o l a s e  

[ 1 5 ]  田 健. 计算机 辅助分 子设计 提高蛋 白质热 稳定 性 的研究 

[ D] . 北京 :中国农业科学院 , 博士学位论文 ,2 0 1 1 .  
T i a n   J .I mp r o v e  t h e   p ot r e i n   t h e r ma l  s t a b i l i t y   b y   t h e   c o mp u t e r  

a i d e d   mo l e c u l a r   d e s i g n[D] .B e i j i n g :C h i n e s e   A c a d e m y   o f  
Ag n c u l t u r a l   S c i e n c e s ,Do c t o r   Di s s e ta r t i o n,2 01   1 .  

g e n e[ D] . B e i j i n g : C h i n e s e   A c a d e my   o f   Ag r i c u l t u r a l   S c i e n c e s ,  
Ma s t e r   Di s s e r t a t i o n.2 0 o 8 .  

a n   J ,W a n g   P,Ga o   S,e t   a 1 . .E n h a n c e d   t h e r mo s t a b i l i t y   o f   [ 1 6 ]  Ti
me t h y l   p a r a t h i o n  h y d r o l a s e  f r o m Oc h r o b a c t r u m s p.M2 3   1  b y  

[ 7 ] C h u   XY, Wu  N  F, D e n g  M  J ,e t   a 1 . .E x p r e s s i o n  o f  
o r g a n o p h o s p h o r u s  h y dr o l se a   OPHC2   i n   P i c h i a   pa s t o r i s :  

r a t i o n a l   e n g i n e e i r n g   o f   a   g l y c i n e   t o   p r o l i n e   m u t a t i o n[ J ] . F E B S  
J . ,2 01 0,2 7 7: 4 9 0 1 —4 9 0 8 .  

P u i r i f c a t i o n   a n d   c h a r a c t e i r z a t i o n[ J ] .P r o t e i n   E x p r .P u i r f . ,  
2 0 0 6,4 9: 9 —1 4 .  

a n   J , Wa n g   P, Hu a n g   L, e t   a 1 . . I mp r o v i n g   t h e   [ 1 7 ]  Ti
t he r mo s t a b i l i t y   o f   me t h y l   p ra a t h i o n   h y d ol r a s e   f r o m  Oc h r o b a c t r u m 

[ 8 ]  S e u n g   P   P, Yo u n g   J   Y. P r o t e i n   t h e r mo s t a b i l i t y : s t r u c t u r e — b se a d  
d i f f e r e n c e   o f   a mi n o   a c i d   b e t we e n   t h e r mo p h i l i c   a n d   me s o p h i l i c  

s p .M2 3 1   u s i n g   a   c o mp u t a t i o n l a l y   a i d e d   m e t h o d[ J ] .A p p 1 .  
Mi c r o b i o 1 .B i o t e c h n o 1 . ,2 01 3,9 7: 2 9 9 7 —3 0 0 6 .  

p r o t e i n s [ J ] . J . B i o t e e h n o 1 . , 2 0 0 4 ,1 1 1 : 2 6 9 - 2 7 7 .   [ 9 ] L o p e z - L l a n o   J , C a m p o s  L   A,  S a n c h o  J .  A l p h a — h e l i x  
s t a b i l i z a t i o n   b y   a l a n i n e   r e l a t i v e   t o   g l y c i n e :r o l e s   o f   p o l a r   a n d  

u   Y ,T i a n   J ,W a n g   P,e t   a 1 . .I mp r o v i n g   t h e   t h e mo r s t a b i l i t y   o f   [ 1 8 ]  S
a   me t h y l  p ra a t h i o n  h y d ol r a s e  b y  a d d i n g  t h e  i o n i c  b o n d  o n  

p r o t e i n   s u r f a c e [ J ] .A p p 1 . B i o c h e m.B i o t e c h n o 1 . ,2 0 1   1 ,1 6 5 :  
9 8 9 -9 9 7 .  

a p o l a r   s o l v e n t  e x p o s u r e s  a n d  o f  b a c k b o n e  e n t op r y [J] .  
P ot r e i n s , 2 0 0 6 , 6 4 ( 3 ) : 7 6 9 — 7 7 8 ,  

h u   X  Y,Ti a n   J,W u   N   F,e t   a 1 . .An   i n t r a mo l e c u l a r   d i s u l id f e   [ 1 9 ]  C
b o n d   i s  r e q ui r e d  f o r  t h e   t h e r mo s t a b i l i t y  o f   me t h y l  p a r a t h i o n  

[ 1 0 ]Z h o u   C,X u e   Y,Ma   Y.E n h a n c i n g   t h e   t h e r m o s t a b i l i t y   o f   a —  
g l u c o s i d a s e  f r o m T h e r mo a n a e r o — b a c t e r  t e n g c o n g e n s  ̄ MB4  b y  

h y d r o l a s e ,O P HC 2[ J ]A p p l ,Mi c r o b i o 1 .B i o t e c h n o 1 . ,2 0 1   0 ,  
8 8: 1 2 5 —1 3 1 .  

s i n g l e   p ol r i n e   s u b s t i t u t i o n[ J ] . J . B i o s c i . B i o e n g . , 2 0 1 0 ,1 1 0 :  
l 2 -1 7 .  

Wu   N  F,De n g   M  J ,L i a n g   G  Y,e t   a 1 . .I s o l a t i o n,p u i r ic f a t i o n   [ 2 O ]  
a n d  c h a r a c t e iz r a t i o n  o f  a  n e w o r g a n o p h o s p h o us r  h y d r o l a s e  

[ 1 1 ]Z h a n g   W, Mu l l a n e y   E   J , L e i   x   G. A d o p t i n g   s e l e c t e d   h y d og r e n  
b o n d i n g  a n d  i o n i c  i n t e r a c t i o n s  f r o m  A s p e r g i l l u s   f u mi g a t u s  
p h y t a s e  s t r u c t u r e  i mp r o v e s  t h e  t h e r mo s t a b i l i t y  o f   A s p e r g i l l u s  

O P HC 2 [ J ] .C h i n . S e i . B u l 1 . . 2 0 0 4, 4 9 : 2 6 8 ~ 2 7 2 .  
c h we i k e r   K  L,Ma k h a t a d z e   G. I . . A  c o mp u t a t i o n l  a a p p r o a c h   or f   [ 2 1 ]  S t h e   r a t i o n a l   d e s i g n   o f   s t a b l e   p r o t e i n s   a n d   e n z y me s :Op t i mi z a t i o n  

n i g e r   P h y A   p h y t a s e [ J ] . A p p 1 . E n v i on r . Mi c ob r i o 1 . , 2 0 0 7 , 7 3 :  
3 0 6 9 —3 0 7 6.  

o f   s u r f a c e   c h rg a e — c h a r g e   i n t e r a c t i o n s [ J ] .Me t h o d s   E n z y mo 1 . ,  
2 0 0 9, 4 5 4: 1 7 5- 21 1 .     B  K. B r a  ̄e u r   R. T h e   r a ma c h a nd r a n   p l o t s   o f   g l y c i n e   a n d   [ 2 2 ]  Ho

[ 1 2 ]Ha n   Z   L, Ha n  S  Y, Z h e n g  S  P, e t   a 1 . .E n h a n c i n g  
t he r mo s t a b i l i t y   o f   a   Rh i z o mu c o r   mi e h e i   l i p se a   b y   e n g i n e e r i n g   a  

d i s u l i f d e   b o n d   a n d   d i s p l a y i n g   o n   t h e   y e a s t   c e l l   s u r f a c e[ J ] .  
A p p 1 . Mi c ob r i o l  B i o t e c h n o 1 . , 2 0 0 9 , 8 5 ( 1 ) : 1 1 7 — 1 2 6 .  

p r e — p r o l i n e [ J ] . B MC   S t uc r t . B i o 1 . , 2 0 0 5 , 5: 1 4   .
[ 2 3 ]  T a k a n o   K ,Hi g a s h i  R,Ok a d a   J ,e t   a 1 . .Pr ol i n e   e f e c t   o n   t h e  
t h e r mo s t a b i l i t y  a n d  s l o w u n f o l d i n g  o f  a  h y p e r t h e r mo p h i l i e  

[ 1 3 ]G r i b e n k o   A   V,P a t e l   M   M, L i u   J , e t   a 1 . . R a t i o n a l   s t a h i l i z a t i 0 n  
o f   e n z y me s   b y   c o mp u t a t i o n a l   r e d e s i g n   o f   s u r f a c e   c h rg a e — c h a r g e  

p r o t e i n [ J ] . J . B i o c h e m. , 2 0 0 9 , 1 4 5 ( 1 ) : 7 9 — 8 5 .  




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